流式細(xì)胞術(shù)的受體占有率（receptor occupancy，RO）分析是一種穩(wěn)健的分析方法，旨在識別、量化和監(jiān)測治療藥物與其靶點的結(jié)合。眾所周知，在藥物臨床研究中，RO分析可輔助劑量設(shè)定、幫助評估生物制劑最小生物效應(yīng)水平、合理劑量并建立合理給藥方案。RO分析可用于安全性評估，評估長期飽和RO導(dǎo)致的毒副作用的可能性。RO通常被視為藥效學(xué)（PD）指標(biāo)，與藥代動力學(xué)（PK）評估相結(jié)合，用于建模PK/PD關(guān)系，是作用于細(xì)胞表面靶點的大分子藥物PK/PD建模的基石。通常在設(shè)計RO的實驗時，需要考慮很多因素，如測試樣本的種類和條件，檢測試劑的特異性及檢測濃度的確認(rèn)，受體表達(dá)的水平和靶細(xì)胞的豐度，靶點在給藥過程中表達(dá)水平的變化和ADA的存在對RO檢測的影響等等。隨著新型雙特異性(BsAbs)和三特異性(TsAbs)療法的發(fā)展，它們可以識別兩到三個獨特的表位，需要更復(fù)雜的實驗設(shè)計來確保RO的正確評估。

RO檢測模式和檢測原理

RO試驗，一般涉及三個類型（如圖1所示）：“結(jié)合受體” 、“游離受體”及”總受體”，基于這三個類型，目前常用受體占有率的檢測主要有兩種模式：一種是通過檢測結(jié)合的受體和總受體水平，計算受體占有率，通常稱為“結(jié)合”模式；另一種是通過檢測游離受體和總受體水平，計算受體占有率，通常稱為“游離”模式。采用響應(yīng)信號值（主要包括平均熒光強(qiáng)度、中位熒光強(qiáng)度和百分比等）作為報告值和計算依據(jù)。 “游離”和“結(jié)合”的分析模式及其許多變體模式已經(jīng)廣泛用于臨床前、臨床開發(fā)和上市后研究，這說明了這些分析在藥物開發(fā)過程中的重要性和實用性。

 圖1. RO的3種基本形式

雙/三特異性抗體受體占位分析方案設(shè)計考量

對于雙/三抗治療藥物的受體占位檢測，若不區(qū)分受體，可采用 “結(jié)合”模式進(jìn)行檢測（如圖2所示），“結(jié)合受體”需使用熒光素標(biāo)記或者生物素標(biāo)記的藥物的特異性抗體來檢測，”總受體”檢測一般需要加入過量的藥物飽和受體，然后使用熒光素標(biāo)記或者生物素標(biāo)記的藥物的特異性抗體來檢測； 

圖2. “結(jié)合”模式總受體檢測原理

若區(qū)分受體，采用雙抗藥物過飽和測總受體的方法是不可取的，因其可與兩/三個受體結(jié)合，因此沒法確定某一受體的表達(dá)量。因此對于雙/三抗區(qū)分受體的檢測，“游離”模式可能是唯一的選擇，需要考量的因素主要有：

（1） “游離受體”檢測一般使用熒光素標(biāo)記的藥物，或者生物素標(biāo)記的藥物，配合熒光素標(biāo)記的鏈霉親和素使用（如圖3所示）。熒光素標(biāo)記或者生物素標(biāo)記抗體或者蛋白是實驗室的常規(guī)操作，僅需要很少的資源即可獲得。其質(zhì)量和穩(wěn)定性可靠，可獲得足夠的量，并且明確可與藥物競爭結(jié)合受體。

“游離受體”檢測也可采用與藥物競爭且親和力相當(dāng)或低于藥物與受體結(jié)合親和力的競爭性抗體（非熒光素標(biāo)記的藥物）來檢測，即結(jié)合同一受體的相同表位（如圖3所示）。前提是篩到這樣的抗體，相對于用熒光素標(biāo)記藥物檢測的方法，該方法人力成本和試劑成本都要高一些，因此第一種方式是比較容易實現(xiàn)的，開發(fā)和驗證一種檢測方法，具備較高的成本優(yōu)勢。

圖3. “游離”模式檢測原理

對于可逆結(jié)合的靶點，隨著檢測抗體濃度不斷增加，藥物與靶點間存在競爭置換的可能，因此需要對檢測抗體的濃度進(jìn)行充分摸索，以尋找最優(yōu)檢測抗體濃度（如圖4所示）。

圖4. 檢測抗體的滴定

（2）”總受體”的檢測，采用非競爭抗體來檢測。非競爭抗體，即一種與藥物結(jié)合同一受體，又與藥物互不干擾的檢測抗體。實際工作中，尋找商業(yè)化的可用的非競爭性試劑來評估總受體是有一定難度的，需要花費很多的時間和財力，甚至可能找不到這樣的試劑。若是未篩選到藥物的非競爭性抗體，總受體檢測可以對給藥前的樣本進(jìn)行藥物的過飽和處理測得總受體水平，但由于受體/靶點在給藥過程中，可能會發(fā)生受體/靶點上調(diào)或下調(diào)（內(nèi)化或脫落等），給藥后受體的表達(dá)水平發(fā)生變化（如圖5所示），可能會高估或低估RO。另外，如果對于一些表達(dá)豐度比較低的受體，無法通過圈門得出陽性比例，只能通過平均熒光強(qiáng)度（MFI）或熒光強(qiáng)度中位值（MdFI）計算得到給藥后不同時間點的RO，而這兩個值會受儀器狀態(tài)、設(shè)置、分析人員和實驗室等影響，因此測定的給藥前總受體水平在一定程度上可能不能真實反饋實際給藥后的總受體水平。

圖5. 給藥后受體調(diào)節(jié)機(jī)制

（3） “自由模式”容易受到ADA和Nab的影響，尤其是使用全血進(jìn)行RO檢測時。如下圖6所示，由于有Nab的產(chǎn)生，加入的檢測試劑被Nab識別中和，因此不能結(jié)合到受體上，最后造成過高的估計藥物的RO水平。而圖7指的是另外一種情況，由于存在ADA，ADA與藥物結(jié)合，進(jìn)而ADA的另外一端可以和標(biāo)記的藥物結(jié)合，或者ADA兩端都可以和標(biāo)記的藥物結(jié)合，造成信號放大，造成過低的估計藥物RO水平，進(jìn)而影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。使用與藥物分子沒有同源序列但與藥物競爭結(jié)合受體的抗體或許可以避免這個問題。

圖6. 中和的ADA可能對RO檢測造成的影響

圖7. 非中和的ADA可能對RO檢測造成的影響

案例分享

熙寧生物有著豐富的基于流式細(xì)胞術(shù)檢測雙/三特異性抗體受體占位的臨床項目經(jīng)驗，開發(fā)了多個雙/三特異性抗體藥的受體占位檢測方法，部分項目經(jīng)驗如下：

1.某雙抗藥物檢測試劑濃度摸索的部分?jǐn)?shù)據(jù)：

圖8 A. 受體A檢測試劑濃度滴定

圖8 B. 受體B檢測試劑濃度滴定

圖8是某雙抗藥物的受體占位檢測試劑濃度滴定的數(shù)據(jù)，從圖上可以看出，對于受體A，檢測抗體與藥物競爭不明顯，可以用于檢測游離受體；對于受體B，檢測抗體與藥物競爭明顯，不能用于檢測游離受體。

表1 受體A RO%穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

表2 受體B RO%穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

表3 受體A和受體B的總的RO%的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

表1、2和3中，由于兩個受體的表達(dá)豐度不一樣，表中HQC和LQC不能通用，分開配制，加藥濃度根據(jù)不同檢測項有所調(diào)整。HQC和LQC樣品在2-8℃保存9天，均滿足接受標(biāo)準(zhǔn)CV≤30%。

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